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臺大學術資產~稻作研究2

我在臺大的稻作研究
文‧圖/劉麗飛

我是1968年進入臺大農藝學系就讀,到現在還記得當時充滿憧憬的愉悅心情,因為我讀了一個以人類糧食為主題的學系,這是多麼重要的工作,值得我為它努力。讀到大三時更愛上作物育種學,當年分子生物學才剛剛冒芽,懵懂的我竟然以“直接將染色體分離出來,再送到細胞裡,達到改良的目的”作為育種學實習的報告,任課的侯愉老師給我很大的鼓勵,評了95分,這是我大學四年中得分最高的一門課,更引發我對作物改良的興趣。

        1972年畢業以後,有幸到茶葉改良場工作,場長是對臺灣茶業貢獻卓著的吳振鐸教授,他對賴光隆教授的稻根組織培養研究很有興趣,因此指定我做茶樹的組織培養,同時協助茶樹育種栽培的工作,這段時間只有一年,卻讓我學到很多,尤其體會到大學所學偏於理論,到了現場,什麼也弄不清楚,一切從頭學起,可是實際去做了,卻又深感理論不足,需要加強,而且在學校時還沒有組培方面的課程,只好照著書本一步步地自己摸索,覺得實在不是辦法,所以一年後又回臺大農藝讀研究所,當時的系主任就是賴光隆教授。我向他表達育種學實習報告的構想,他就給了我兩篇菸草的研究報告,原來菸草已經可以藉由酵素分解細胞壁,得到原生質體,再進一步培養與融合,將二種野生菸草的染色體組合在一起,產生一個新的體細胞雜種,這真是了不起的突破,我歡喜萬分,躍躍欲試,經過深入討論後,決定在賴教授指導下對水稻進行相關研究,自此一頭栽進水稻的世界。

        一開始,我信心滿滿,相信既然菸草可以培養成功,水稻應當也不難,未料禾本科植物與茄科植物完全不同,第一步從葉片分離原生質體就非常困難,進一步培養,試了又試,水稻原生質體就是無動於衷,每一次的培養結果都失敗,相當挫折,信心開始動搖,碩士畢業後,考慮先去工作,這時賴教授輕描淡寫地說了一句話:「能念書的時候,就該好好把握機會早點念啊!」就這樣,因為老師的支持與鼓勵,我又鼓起勇氣繼續讀博士班。然而試驗一次又一次地做,紀錄一本又一本地加厚,水稻原生質體的培養始終沒有動靜,壓力非常大,常常在夢中看到一顆顆原生質體滾來滾去而驚醒。漸漸地,國內外有些也研究水稻原生質體的學者都放棄了,很多關心我的師友勸我改材料,換個容易培養的植物,可以做很多深入的研究,這讓我常常陷入天人交戰。可能個性中有種執著吧,最後還是堅持下去,博士班5年,分析了水稻原生質體的其他特性,培養方面還是交了白卷,畢業時並不是很開心,論文離我的理想實在太遙遠。感恩的卻是,系裡系外的老師都對我愛護有加,恩師賴光隆教授更是從未責難。

        畢業後有了全新的開始,感謝農藝系的師長給我機會留下來任教,我成了農藝系第一位女老師。面臨了教學與研究的挑戰,必須思考研究方向,我可以重新選擇試驗材料嗎?還記得在一次參加研討會的旅程中,與賴教授討論這個問題,他又一次輕描淡寫地說了一句話:「水稻是這麼重要的作物,還是應該有人繼續研究啊!」從此以後,我對我的研究材料再也沒有發出任何疑問,直到2007年退休,很歡喜的做了一些有趣的研究,由於前後時間上互相交錯,不容易依時序說明,所以分項來介紹。

 

水稻原生質體培養
        回想起來,賴教授給我的指導是正確的,而我自己的堅持也非常值得。1980年博士班畢業後,繼續與水稻原生質體奮戰了數年,最後終於解決了培養的困難,當第一眼看到由水稻原生質體生長出來的細胞團時,還非常懷疑,經重覆驗證後,才相信是真的。突破了這個難關,以後的試驗就順利多了。這時有王國忠、陳彥雄(現任農委會農糧署雜糧特作科科長)、鄭誠漢(現任農藝系技正)等碩士班研究生加入研究,大幅度提高原生質體培養、融合及再生效率,其中鄭誠漢先生參與時間最久,非常認真投入,得到水稻品種間的體細胞雜種,並嘗試用將水稻細胞質雄不稔性(CMS)轉移至栽培種,此外更嘗試水稻與稗子、水稻與狼尾草的原生質體融合,雖然成功得到雜種細胞系,可惜沒法進一步再生為植株。其後原生質體融合的研究漸漸減少,因為將兩套染色體組合在一起,容易產生不親和,問題很多,不是好的改良方法,而且,基因轉殖技術開始研發出來了,這是更有效率的改良方法。

 

水稻基因轉殖
        原生質體研究漸漸停下來,1987-88年我申請到國科會進修計畫,前往美國康乃爾大學,在吳瑞教授研究室進修一年,學習分子生物學與基因轉殖技術,回國後,正式開始水稻基因轉殖的研究,這方面的工作陸續有王國忠、林怡君(現任職環保署)、趙雲洋(現任臺大農藝系博士後研究員)、洪傳揚(現任臺大農化系助理教授)、李鎮宇(現任職屏科大農園生產系)、陳斯婷(現就讀陽明大學微生物暨免疫學研究所博士班)、周書旭、王伯豪(現就讀美國賓州大學博士班)等人加入,因著大家的努力,逐步建立粒子槍法及農桿菌法基因轉殖系統,得到轉殖水稻植株,具有稔性,可得到正常之後代。前後陸續轉殖的基因包括:pinⅡ基因(抗蟲),海藻糖合成基因(耐旱)、MAPK基因(耐旱、鹽)、CBF基因(耐冷)、salT基因(耐旱、鹽)、osmotin基因(耐旱、鹽)及phytase基因(減少環境汙染)等,也分別進行各項農藝性狀與基因表現的分析。其中phytase基因轉殖水稻的構想,是希望把收穫的水稻穀粒添加於豬、雞飼料,phytase可以幫助分解phytic acid,將磷釋放出來提供豬、雞利用,相對降低糞尿中磷含量,減少糞尿對環境的汙染,這是與中研院分生所余淑美博士合作,余博士同時也受聘為臺大農藝系兼任教授,聯合指導洪傳揚完成博士論文,因為投入時間較長,內容比較完整,得到非常具體的結果,並且有技術轉移給廠商,希望推動為商業生產產品。

 

水稻細胞培養及植株再生的研究
        植物細胞具有分化全能性,即使變成單一細胞,經過培養後,也能分化再生成為完整植株,可是水稻的 分化性似乎比較困難,不利於基因改良,因此我也花了一些時間來探討水稻植株再生的問題。首先選擇了30幾個品種進行培養,發現培養的細胞較乾,其再生植株的能力比較好,進一步證實以高濃度mannitol,sorbitol,agar等處理,對細胞造成高滲壓,可以有效促進細胞分化,再生為植株,其提高率達50%-90%,明顯提高水稻細胞培養的應用價值。一般的組培,在得到理想的培養條件,可以實際應用就很滿意了,可是我想深入了解,為什麼可以透過水分調節來影響細胞分化?究竟有什麼機制?

        很高興有兩位博士班研究生、一位碩士生參加這個問題的研究,由曾一真小姐(碩)、李佳蕙(卉)小姐(現任職國科會生物處副研究員)探討植物荷爾蒙代謝,黃文理先生(現任國立嘉義大學農藝系副教授)探討細胞內糖與澱粉代謝、相關酵素的變化等,試驗中發展了酵素免疫定量法(ELISA)及組織免疫化學(Immunohistochemistry),結果發現滲透壓處理導致細胞內生長素(IAA)的累積,影響植物荷爾蒙cytokinin及ABA的代謝,同時促進澱粉的合成與累積,當移除滲透壓處理時,迅速降低IAA含量,促進澱粉分解,提高glucose含量,經由這些變化造成細胞分化與植株再生。這個研究成果曾經在國際學術會議上發表,受到重視,有學者反應,他們回去試驗後,證實滲透壓處理確實非常有效而且實用。目前這個題目只做到滲透壓處理下與再生過程中的生理變化,很期盼有人能從分子生物學的角度,深入了解基因表現與調控的機制。

 

水稻培養細胞再生植株之體細胞變異
        經由細胞培養再生的植株容易發生變異,這是屬於體細胞變異,其原因還不清楚,也無法掌控,如果變異太多當然就會影響基因改良的效果。這個題目就由研究生陳韻雯小姐(現任職中央研究院分生所研究助理)進行,這是一個非常辛苦的工作,韻雯每天在田裡認真埋頭苦幹,收穫了數千稻株,一株一株地考種、記錄、分析資料,結果發現第一代的再生植株(R0世代)表現與原來品種差異不大,但是R0世代自交繁殖產生的R1世代,與R1世代再自交繁殖產生的R2世代中,卻發生各種性狀之變異,並呈現極複雜之分離現象,推測在培養過程中導致許多隱性的突變,此種變異的頻率及範圍隨著培養時間明顯增加,但不受滲透壓處理的影響。這個結果提供了重要的訊息,日後基因轉殖試驗必須慎選材料及培養方法,以避免發生體細胞變異。

珍貴的水稻穎突變體,可用於探討穎花發育的機制。
    a:內外穎發育嚴重受阻的突變體
    b:內外穎發育部分受阻的突變體
    c:正常水稻穎花

 

水稻懸浮培養細胞生理
        這項研究,是與本系高景輝教授合作,由研究生宋弘毅先生負責,主要探討懸浮培養細胞生長所需要的條件,及細胞生長過程中的生理變化,例如:缺糖時,α-澱粉分解酵素活性的變化及不同氮源下多元氨的變化等。

 

水稻α-澱粉分解酵素基因表現之調控與利用
        這一項研究非常有趣,是與余淑美教授合作,最初是由研究生郭彥宏先生(現在美國工作)進行,原始的構想,是希望利用水稻懸浮培養細胞大量迅速繁殖的優勢,探討植物荷爾蒙GA與ABA調控α-澱粉分解酵素基因表現的機制,一開始試驗並不順利,完全看不出有調控基因表現的現象,但是延長培養時間以後,α-澱粉分解酵素大量表現,仔細推究原因,赫然發現是培養基中糖份用完了,缺糖的狀況誘導α-澱粉分解酵素基因表現,其蛋白質產物並可分泌到培養基內。這個發現在植株上是不可能看到的,因為沒法控制完全缺糖,只有在細胞培養的系統中才能清楚呈現。由於余淑美博士的積極與認真,從此開啟了一系列有趣的研究:了解了糖如何調控基因表現的分子機制,並進一步把這種調控機制研發為高價值重組蛋白質分子之生產系統,又因為這些研究而申請到了數項專利。

 

水稻內外穎相關基因之研究
        這也是我非常喜愛的一項試驗,因為對植物花、葉片、根等的發育極有興趣,相關報告中有各式各樣的突變體,因此常常在想水稻穎花會有什麼樣的突變?可以改變內外穎的構造嗎?有一次有幸參觀農試所王強生博士、曾東海先生團隊水稻突變的材料,意外發現一個內外穎發育受到抑制的突變水稻,內外穎非常小,完全沒法結實,所以水稻收穫以後,這個植株不會被保留下來,記載中就從來沒有人發現到這種突變體,而我卻正巧能在開花的時候看到,真是欣喜若狂,此後花了些時間,努力繁殖了這個突變體,研究生劉昌郎先生(現任職雲林縣麥寮鄉公所)、康家豪先生(現任臺大農藝系研究助理)先後利用基因表現分析及晶片分析,進行基因比對,找出可能與內外穎發育有關基因,林雅芬小姐(現在荷蘭攻讀博士)並進行基因轉殖、In situ hybridization等相關分析,希望確認基因功能與基因表現之調控,可惜結果未能證明所轉殖基因與內外穎發育有關。2007年我退休後,把這個有趣的材料送給農藝系陳凱儀助理教授,他和研究生王聖善先生經過兩年研究,有很好的發現,明確地找到與內外穎發育有關的基因,這真是非常令人欣喜的事,很高興有人能繼續這個研究。

不同品種水稻之癒合組織分化再生植株能力有極大差異,啟發我思考究竟是什麼原因導致這種差異,最後發現滲透壓處理影響植株的再生機制。
    a:癒合組織再生植株能力高
    b:癒合組織可以分化小苗,但無法長成植株
    c:癒合組織無法分化再生植株
    d:癒合組織容易褐化,無法分化再生植株

 

其他研究
        除了上述與水稻有關的研究以外,我也花了些時間發展多重PCR(聚合酶連鎖反應)技術,建立快速檢測基因轉殖玉米與大豆的方法,以期有效管控飼料的安全性,其中有來自尼泊爾的博士生哈利先生參與計畫,我退休後就移交給農藝系胡凱康副教授,並邀請他與本系張孟基助理教授共同繼續指導哈利,預計今年底可以順利畢業。

        另外也與本系張孟基助理教授共同著手探討了葉片發育的問題,不過研究材料選用了菸草,二位非常認真的碩士研究生劉秋萍小姐(現就讀臺大生物科技研究所博士班)、林維怡小姐(現就讀中研院生物科技研究所博士班)分別篩選出控制細胞分裂有關的基因,進行基因轉殖,觀察對葉片發育的影響,這也是非常有趣的題目,不過目前處於暫停的狀態,期待有緣人能繼續這方面的研究。

        從1968年進入臺大就讀開始,到現在約40年了,非常感恩賴光隆教授對我的啟發,引領我進入水稻的領域,雖然有些研究工作並不成功,但是每一個過程都讓我學習、讓我深思、讓我歡喜,能有機會做自己喜歡的事是最幸福的。因為對生命的領悟,我提早退休,離開研究工作,但是沒有離開水稻,而是以另一種方式,向社會大眾傳遞健康飲食的觀念,讓大家認識米飯,健康的吃米飯,感覺上我與稻米更親近了,我想這會是一輩子的工作。

        最後還是要說明,本文只是簡單描述我個人在水稻研究的歷程,事實上,臺大還有很多教授、同學對水稻研究有卓著貢獻,更值得大家努力發掘,讓我們一起向這些默默的工作者致敬。

 

劉麗飛小檔案
1968年進入臺大農藝學系就讀,1972年畢業,1972-3年任茶業改良場研究助理,1975年取得臺大農藝所碩士,1980年取得臺大農藝所國家博士。1981年擔任農藝系講師,次年升任副教授,1987-88年赴美國康乃爾大學研究一年,1989年升任教授,並兼任人工氣候室主任,1999年再赴美國康乃爾大學研究半年,2007年退休,獲聘農藝學系名譽教授。退休後,繼續在校開授兩門通識課程:1.植物與糧食和2.飲食與文化;及新生專題課程:預約美麗人生;此外,於中正紀念堂開授終身學習課程,推廣健康飲食新觀念。

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